高效液相色谱法测定人血浆中全反式维甲酸血药浓度

【关键词】  血药浓度
    摘要:目的 建立高效液相色谱法测定人血浆中全反式维甲酸浓度。方法 色谱柱为Supelcosil LC18DB柱（5 μm,4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇水冰乙酸(体积比82∶17∶1)；柱温为室温；流速1.5 mL・min-1；检测波长为340 nm。结果 全反式维甲酸血药质量浓度在10～1000 ng・mL-1范围内，与峰面积比有良好的线性关系（r=0.9997），最低检测浓度为2.5 ng・mL-1。平均方法回收率为（94.5±4.7）%（n=15）。日内RSD≤4.1%，日间RSD≤6.2%。结论 本方法简单、快速、灵敏、重现性好，适用于全反式维甲酸临床血药浓度监测及人体药代动力学研究。
　　关键词:全反式维甲酸；血药浓度；高效液相色谱法
　　Abstract: Objective To establish a HPLC method for determination of alltrans retinoic acid in human plasma.  Methods A Supelcosil LC18DB column (5 μm,4.6 mm×250 mm) was adopted. Mobile phase was a mixture of methanol,water and glacial acetic acid（82∶17∶1）. The flow rate was 1.5 mL・min-1. The UV detection wave was  340 nm. ResultsThe assay procedure was shown to produce linear calibration curves over the range of 10 ng・mL-1 to 1000 ng・mL-1 of alltrans retinoic acid in plasma (r=0.9997). Within the range,the recovery rate was (94.5±4.7)%,and the intraday RSD and interday was less than 4.1% and 6.2%,respectively. The detection limit of all trans retinoic acid was 2.5 ng・mL-1. Conclusions This method is repeatable,convenient and sensitive for plasma concentration monitoring and clinical pharmacokinetics study of alltrans retinoic acid.
　　Key words:alltrans retinoic acid; plasma concentration; HPLC
    全反式维甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA) 是维生素A 的天然氧化代谢产物，可抑制白血病细胞的增殖，诱导白血病细胞分化成熟，是目前治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的有效药物。ATRA对APL初发患者完全缓解率可达85％以上，但对复发患者再次应用ATRA则效果不佳，其原因可能是ATRA对参与其代谢的酶活性具有自身诱导作用，持续用药导致血药浓度逐步降低［1］。本文参考文献［2-4］，建立了一种灵敏、准确的ATRA血药浓度HPLC测定法，旨在为全反式维甲酸临床血药浓度监测及人体药代动力学研究提供测定方法。
　　1  材料与方法
　　1.1  仪器
 
　　Waters高效液相色谱仪（515型恒流泵，486型紫外检测器，Millennium32色谱工作站）；XW―80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；3K18高速冷冻离心机（Sigma）；高速离心机（美国雅培公司TDx仪附件）。
　　1.2  药品与试剂
　　ATRA对照品(Sigma,纯度：98％)，阿维A酸（内标，罗氏公司），甲醇为色谱纯试剂，其余试剂均为分析纯。
　　1.3  色谱条件
　　色谱柱为Supelcosil LC18DB柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温为室温。流动相：甲醇水冰乙酸（体积比82∶17∶1）；流速1.5 mL・min-1。检测波长340 nm。
　　1.4  血药浓度测定法
　　1.4.1  ATRA对照溶液配制  
　　精密称取ATRA对照品适量，以甲醇溶解并定容，制得浓度为100 μg・mL-1的ATRA储备液。将ATRA储备液以甲醇稀释，配制浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg・mL-1的ATRA对照溶液。
　　1.4.2  内标液配制  
　　取内标阿维A酸适量，置于100 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得浓度为7.5 μg・mL-1的内标液。
　　1.4.3  样本处理  
　　精密吸取血浆样品1 mL，置10 mL具塞离心试管中，加入内标溶液20 μL，旋涡混合30 s。加入1 mol・L-1的HCl溶液500 μL，漩涡混合30 s，再加入乙酸乙酯3 mL，旋涡混合1 min，4 500 r/min离心5 min。转移上层液至尖底试管中，于37 ℃水浴中氮气流吹干。残渣加入流动相200 μL漩涡混合30 s使溶解，10 000 r/min离心5 min，取上清液50 μL进样，记录色谱图，以ATRA峰面积（As）与内标峰面积（Ai）之比代入标准曲线计算ATRA血药浓度。
　　1.4.4  标准曲线  
　　精密量取空白血浆1 mL，置10 mL具塞离心管中，分别加入不同浓度ATRA对照溶液20 μL，混匀，使血药浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000 ng・mL-1。按样本处理方法操作，以不同浓度ATRA系列溶液的As和Ai来计算A（A=As/Ai），以A值为纵坐标，ATRA质量浓度(ρ)为横坐标进行直线回归。

　　1.4.5  回收率及精密度  
　　分别于1 mL空白血浆中加入低、中、高3种浓度的ATRA对照溶液20μL，混匀，使其浓度分别为10、200、1000 ng・mL-1，按样本处理方法操作，计算ATRA血药浓度，以测得浓度与配制浓度之比计算方法回收率。另以甲醇配制相应系列浓度的ATRA溶液，不经提取直接测定，以此为标准，将两组峰面积相比，计算ATRA萃取回收率。以1 d内测得的ATRA浓度计算日内精密度，以1周内5次测定的ATRA浓度计算日间精密度。
　　2  结 果
　　2.1  色谱行为
  　在上述色谱条件下，ATRA与内标物及血浆内源性物质能够较好分离，ATRA与内标的保留时间分别为8.8 min和6.7 min。空白血浆及血浆样品色谱图见图1。
　　2.2  线性范围
　　ATRA血药质量浓度(ρ)在10～1000 ng・mL-1范围内，与峰面积比(A)有良好线性关系，其回归方程为：A=00116ρ+0.0036，r=0.9997。以信噪比S/N=3：1计，ATRA最低检测浓度为2.5 ng・mL-1。
　　2.3  回收率及精密度
　　高、中、低3种浓度的提取回收率分别为（84.6±5.2）%、（81.2±6.3）%、（81.6±4.6）％，平均方法回收率为（94.5±4.7）%（n=15）。3种浓度的日内RSD≤4.1%，日间RSD≤6.2%。结果见表1。表1  回收率及精密度（略）
　　3  讨 论
　　本文建立了一种灵敏、准确的ATRA血药浓度高效液相色谱测定法，适用于APL病人ATRA 血药浓度的常规监测及临床药代动力学研究。通过监测ATRA血药浓度，可以更好地了解在某些APL病人连续用药治疗中临床复发及耐药的原因。
　　ATRA化学性质活泼，见光易异构化或氧化降解，因此在样品提取过程中应特别注意避光操作。提取过程中血浆加入1 mol・L-1 HCl溶液，使血浆酸化，可提高萃取回收率，乙酸乙酯一步萃取可使萃取回收率达到80％以上。
　　由于ATRA中的羧基可以与色谱柱中的硅醇基等发生相互作用，导致色谱峰拖尾，在流动相中加入1％(ω)醋酸，可抑制这种作用，消除ATRA峰拖尾现象。
　　参考文献:
　　［1］MUINDI J,FRANLCEL S R,MILLER W H,et al. Continuous treatment with all - trans retinoic acid causes a progressive reduction in plasma drug concentrations: implications for relapse and retinoid "resistance" in patients with acute promyelocytic leukemia［J］. Blood,1992,79: 299.
　　［2］余自成，姚帅，郁人海.高效液相色谱法同时检测人血清中全反式及13-顺式维甲酸浓度［J］.药物分析杂志，2000，20(4):226.
　　［3］MICHIKO M,HIROKAZU Y, HARUKO,et al. Simultaneous quantification of retinol,retinal,and retinoic acid isomers by highperformance liquid chromatography with a simple gradiation［J］. J  Chromatogr  B,2001，757: 365.
　　［4］CARSTEN K S,ABRAHAM B, HEINZ N. Chromatographic analysis of endogenous retinoids in tissues and serum［J］. Anal Biochem,2003,315:36.