温肾调经颗粒质量标准研究
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李红英 于得才 杨丽 闫建坤
【摘要】 目的建立温肾调经感咳颗粒的质量标准。方法采用TLC法对处方中的肉苁蓉、菟丝子、茜草进行定性鉴别;采用HPLC法测定阿魏酸的含量。色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相为甲醇-5%醋酸(20:80);流速为1.0ml/min;检测波长323nm。结果进样浓度在2.50～20.00μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9999);平均回收率98.54%，RSD为1.22%(n=5)。结论本方法操作简单，准确可靠，重复性好，可作为温肾调经颗粒的质量控制方法。
【关键词】 温肾调经颗粒;阿魏酸;薄层色谱;高效液相色谱
Study on quality control standarad of Wenshen Tiaojing Granules
LI Hong-ying， YU De-cai, YANG Li ,et al.Shandong Wego Medicine Co., Ltd.,Weihai 264209, China
[Abstract]ObjectiveThe quality Control Standarad of Wenshen Tiaojing Granules were established.MethodsA TLC method was used for the qualitative identification of Cistanches Herba and Rubiae Radix Et Rhizoma and Cuscutae Semen in the formula.The content of Ferulic Acid was determined by a HPLC method with a Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)column and a mobile phase consisted of Methanol- 5%Acetic Acid(20: 80).The flow rate was 1.0ml/min.The detection wavelength was 323nm.ResultsThe linear relation was good within the range of 2.50～20.00μg/ml(r=0.9999)and average recovery was 98.54%,RSD1.22%(n=5).ConclusionThe method was simple,accurate,reliable and reproducible.It could be used in the quality control method of Wenshen Tiaojing Granules.
[Key words]Wenshen Tiaojing Granules;Ferulic Acid;TLC;HPLC
温肾调经颗粒主要由当归、杜仲、菟丝子、肉苁蓉、茜草等药物组成，其处方来源于临床验方，具有温肾养血，利温化浊，祛瘀调经之功效，临床上用于肾阳不足，冲任血虚，湿浊瘀阻所致之月经后期，经量稀少，甚或经闭不通的治疗，效果显著，是我国在多囊卵巢综合征研究领域惟一进入临床阶段研究的中药制剂。本研究对其质量标准进行了定性和定量研究，制定了肉苁蓉、菟丝子、茜草的薄层色谱定性鉴别，并建立了制剂中阿魏酸的高效液相色谱含量测定方法。
1仪器与试药
岛津SCL-10AVP液相色谱仪(日本)，SPD-10AVP检测器，Class-VP工作站，KQ3200DE型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);优普超纯水机UP-Ⅱ-10T(成都超纯科技有限公司);1/万及1/10万电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。温肾调经颗粒(自制);毛蕊花糖苷对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号1530-200202);菟丝子对照药材(中国药品生物制品鉴定所，批号21232-200401);茜草对照药材(中国药品生物制品鉴定所，121049-0301);阿魏酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，100834-200701);硅胶G(薄层色谱用，青岛海洋化工厂);甲醇为色谱纯，水为自制二次重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1定性鉴别
2.1.1肉苁蓉的薄层色谱鉴别取本品10g，加甲醇50ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1～2ml使溶解，作为供试品溶液。另取麦角甾苷对照品，加乙醇制成每1ml含2.5mg的溶液。另取不含肉苁蓉的样品同法制成阴性对照液。照薄层色谱法(《中国药典》[1]2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-9%醋酸(20:3:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5% FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无干扰。
2.1.2菟丝子的薄层色谱鉴别取本品5g，加甲醇60ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，滤过，滤液浓缩至1～2ml，作为供试品溶液。另取菟丝子对照药材1g，研碎，加甲醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，滤过，滤液浓缩至1～2ml，作为对照药材溶液。再取菟丝子阴性样品同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(5:5:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。
2.1.3茜草的薄层鉴别取本品10g，加甲醇50 ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿溶解，滤过，滤液浓缩至1～2 ml，作为供试品溶液。另取茜草对照药材1g，研碎，加甲醇10ml，超声处理30min，同法制成对照药材溶液。再取茜草阴性样品同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。
2.2阿魏酸的含量测定
2.2.1色谱条件Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相为甲醇-5%醋酸(20:80);流速为1.0ml/min;检测波长323nm，柱温35℃。
2.2.2对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇:5%醋酸(1:4)的溶液制成每1ml含阿魏酸10μg的溶液，即得。
2.2.3供试品溶液的制备取本品适量，研细，取1.4g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇:5%醋酸(1:4)混合溶液25ml，称重，超声处理(功率160W，频率50kHz)40min，放冷，再称重，用以上溶剂补充减失的重量，滤过，取续滤液经微孔滤膜(0.45μm)，即得。
2.2.4阴性对照溶液制备按处方比例称取除当归和川芎以外的药材，按制备工艺制成缺当归和川芎的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.2.5专属性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，结果表明，阴性对照品溶液在对照品、供试品溶液相对保留时间处无干扰峰出现，本研究方法可行。色谱峰见图1。
2.2.6 线性范围考察精密称取阿魏酸对照品适量,加甲醇:5%醋酸(1:4)混合溶剂制成每1ml含50μg的对照品溶液，分别精密吸取该溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0ml置10ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，分别吸取20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算，以峰面积对浓度回归，得回归方程Y=118234X+3026.98 r=0.9999，结果表明：阿魏酸在2.50～20.00μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
2.2.7精密度试验精密吸取阿魏酸对照品溶液,连续进样5次，每次20μl，计算峰面积的相对标准偏差RSD1.4%，表明本法精密度良好。
2.2.8重复性试验制备供试品溶液5份，分别进样，每次20μl，测定阿魏酸平均质量分数为0.1205mg/g, RSD 0.56%,结果表明本法重复性好。
2.2.9稳定性试验对同一供试品溶液每隔3h进样1次，每次20μl，共4次，依法测定，结果阿魏酸峰面积RSD 0.41%，表明供试品溶液在9h内稳定。 A对照品;B 阴性对照;C.供试品
图1温肾调经颗粒HPLC图谱
2.2.10加样回收率试验取已知含量样品粉末0.7g，精密称定，精密加入一定量阿魏酸对照品，按照拟定的方法测定，计算回收率，结果见表1。表1阿魏酸加样回收率试验(n=5)
2.2.11样品测定分别取不同批号的样品1.4g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样20μl，计算供试品含量，结果3批温肾调经颗粒中阿魏酸含量分别为0.1205、0.1221、0.1235 mg/g。
3讨论
肉苁蓉、菟丝子、茜草为本品中主要的3味药，本研究参考文献[2],建立了以上3味药材的TLC鉴别方法，结果表明所建立的方法展开系统分离效果好，斑点清晰，专属性强，阴性无干扰。本品为中药复方制剂，成分比较复杂，处方中当归为君药，故选定其活性成分阿魏酸作为定量检测指标，建立了HPLC含量测定方法、方法学研究表明该法具有简便、灵敏、重现性好的特点，可以用于本品的质量控制方法。
【参考文献】
1国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).2010：附录34.
2国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社，2005：90;162;217.
【摘要】 目的建立温肾调经感咳颗粒的质量标准。方法采用TLC法对处方中的肉苁蓉、菟丝子、茜草进行定性鉴别;采用HPLC法测定阿魏酸的含量。色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相为甲醇-5%醋酸(20:80);流速为1.0ml/min;检测波长323nm。结果进样浓度在2.50～20.00μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9999);平均回收率98.54%，RSD为1.22%(n=5)。结论本方法操作简单，准确可靠，重复性好，可作为温肾调经颗粒的质量控制方法。
【关键词】 温肾调经颗粒;阿魏酸;薄层色谱;高效液相色谱
Study on quality control standarad of Wenshen Tiaojing Granules
LI Hong-ying， YU De-cai, YANG Li ,et al.Shandong Wego Medicine Co., Ltd.,Weihai 264209, China
[Abstract]ObjectiveThe quality Control Standarad of Wenshen Tiaojing Granules were established.MethodsA TLC method was used for the qualitative identification of Cistanches Herba and Rubiae Radix Et Rhizoma and Cuscutae Semen in the formula.The content of Ferulic Acid was determined by a HPLC method with a Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)column and a mobile phase consisted of Methanol- 5%Acetic Acid(20: 80).The flow rate was 1.0ml/min.The detection wavelength was 323nm.ResultsThe linear relation was good within the range of 2.50～20.00μg/ml(r=0.9999)and average recovery was 98.54%,RSD1.22%(n=5).ConclusionThe method was simple,accurate,reliable and reproducible.It could be used in the quality control method of Wenshen Tiaojing Granules.
[Key words]Wenshen Tiaojing Granules;Ferulic Acid;TLC;HPLC
温肾调经颗粒主要由当归、杜仲、菟丝子、肉苁蓉、茜草等药物组成，其处方来源于临床验方，具有温肾养血，利温化浊，祛瘀调经之功效，临床上用于肾阳不足，冲任血虚，湿浊瘀阻所致之月经后期，经量稀少，甚或经闭不通的治疗，效果显著，是我国在多囊卵巢综合征研究领域惟一进入临床阶段研究的中药制剂。本研究对其质量标准进行了定性和定量研究，制定了肉苁蓉、菟丝子、茜草的薄层色谱定性鉴别，并建立了制剂中阿魏酸的高效液相色谱含量测定方法。
1仪器与试药
岛津SCL-10AVP液相色谱仪(日本)，SPD-10AVP检测器，Class-VP工作站，KQ3200DE型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);优普超纯水机UP-Ⅱ-10T(成都超纯科技有限公司);1/万及1/10万电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。温肾调经颗粒(自制);毛蕊花糖苷对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号1530-200202);菟丝子对照药材(中国药品生物制品鉴定所，批号21232-200401);茜草对照药材(中国药品生物制品鉴定所，121049-0301);阿魏酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，100834-200701);硅胶G(薄层色谱用，青岛海洋化工厂);甲醇为色谱纯，水为自制二次重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1定性鉴别
2.1.1肉苁蓉的薄层色谱鉴别取本品10g，加甲醇50ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1～2ml使溶解，作为供试品溶液。另取麦角甾苷对照品，加乙醇制成每1ml含2.5mg的溶液。另取不含肉苁蓉的样品同法制成阴性对照液。照薄层色谱法(《中国药典》[1]2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-9%醋酸(20:3:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5% FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无干扰。
2.1.2菟丝子的薄层色谱鉴别取本品5g，加甲醇60ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，滤过，滤液浓缩至1～2ml，作为供试品溶液。另取菟丝子对照药材1g，研碎，加甲醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，滤过，滤液浓缩至1～2ml，作为对照药材溶液。再取菟丝子阴性样品同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(5:5:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。
2.1.3茜草的薄层鉴别取本品10g，加甲醇50 ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿溶解，滤过，滤液浓缩至1～2 ml，作为供试品溶液。另取茜草对照药材1g，研碎，加甲醇10ml，超声处理30min，同法制成对照药材溶液。再取茜草阴性样品同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。
2.2阿魏酸的含量测定
2.2.1色谱条件Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相为甲醇-5%醋酸(20:80);流速为1.0ml/min;检测波长323nm，柱温35℃。
2.2.2对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇:5%醋酸(1:4)的溶液制成每1ml含阿魏酸10μg的溶液，即得。
2.2.3供试品溶液的制备取本品适量，研细，取1.4g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇:5%醋酸(1:4)混合溶液25ml，称重，超声处理(功率160W，频率50kHz)40min，放冷，再称重，用以上溶剂补充减失的重量，滤过，取续滤液经微孔滤膜(0.45μm)，即得。
2.2.4阴性对照溶液制备按处方比例称取除当归和川芎以外的药材，按制备工艺制成缺当归和川芎的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.2.5专属性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，结果表明，阴性对照品溶液在对照品、供试品溶液相对保留时间处无干扰峰出现，本研究方法可行。色谱峰见图1。
2.2.6 线性范围考察精密称取阿魏酸对照品适量,加甲醇:5%醋酸(1:4)混合溶剂制成每1ml含50μg的对照品溶液，分别精密吸取该溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0ml置10ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，分别吸取20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算，以峰面积对浓度回归，得回归方程Y=118234X+3026.98 r=0.9999，结果表明：阿魏酸在2.50～20.00μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
2.2.7精密度试验精密吸取阿魏酸对照品溶液,连续进样5次，每次20μl，计算峰面积的相对标准偏差RSD1.4%，表明本法精密度良好。
2.2.8重复性试验制备供试品溶液5份，分别进样，每次20μl，测定阿魏酸平均质量分数为0.1205mg/g, RSD 0.56%,结果表明本法重复性好。
2.2.9稳定性试验对同一供试品溶液每隔3h进样1次，每次20μl，共4次，依法测定，结果阿魏酸峰面积RSD 0.41%，表明供试品溶液在9h内稳定。 A对照品;B 阴性对照;C.供试品
图1温肾调经颗粒HPLC图谱
2.2.10加样回收率试验取已知含量样品粉末0.7g，精密称定，精密加入一定量阿魏酸对照品，按照拟定的方法测定，计算回收率，结果见表1。表1阿魏酸加样回收率试验(n=5)
2.2.11样品测定分别取不同批号的样品1.4g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样20μl，计算供试品含量，结果3批温肾调经颗粒中阿魏酸含量分别为0.1205、0.1221、0.1235 mg/g。
3讨论
肉苁蓉、菟丝子、茜草为本品中主要的3味药，本研究参考文献[2],建立了以上3味药材的TLC鉴别方法，结果表明所建立的方法展开系统分离效果好，斑点清晰，专属性强，阴性无干扰。本品为中药复方制剂，成分比较复杂，处方中当归为君药，故选定其活性成分阿魏酸作为定量检测指标，建立了HPLC含量测定方法、方法学研究表明该法具有简便、灵敏、重现性好的特点，可以用于本品的质量控制方法。
【参考文献】
1国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).2010：附录34.
2国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社，2005：90;162;217.
温肾调经颗粒质量标准研究
李红英 于得才 杨丽 闫建坤 【摘要】 目的建立温肾调经感咳颗粒的质量标准。方法采用TLC法对处方中的肉苁蓉、菟丝子、茜草进行定性鉴别;采用HPLC法测定阿魏酸的含量。色谱柱为Kro
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